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    Ecyton Competent Cells

    ECC化學感受態(tài)細胞,無需熱激及額外培養(yǎng)恢復,實現(xiàn)簡單、快速、高效質粒轉化

    Ecyton Competent Cells

    ECC是一種化學感受態(tài)細胞,經(jīng)過特殊的方法制備,不需要熱激以及額外培養(yǎng)恢復等過程,可實現(xiàn)簡單快速高效的質粒轉化。ECC的制備過程、解凍方法、與質粒DNA混合以及混勻方式較經(jīng)典方法有所不同,是其實現(xiàn)快速高效轉化的關鍵。ECC轉化效率為10^8-10^9/ug pUC19 DNA,可用于克隆、亞克隆、基因文庫構建等研究。

    詳細說明

    儲存條件

    -70℃,六個月有效 

    操作步驟(所有步驟須戴實驗手套操作)

    1、培養(yǎng)皿提前預熱平衡至室溫或37℃。 

    2、將適量體積的質粒DNA或連接產(chǎn)物置于1.5 ml試管中進行冰預冷。 

    3、從低溫冰箱中取出ECC,用手指快速反復擦拭試管外壁,直至約1/3 ECC融化。 

    4、用吸頭輕輕攪拌均勻,快速移取10-100 μl ECC加入已預冷的質粒DNA、連接或重組產(chǎn)物中。 

    5、立即進行中低速(渦旋儀速度建議調至50%)渦旋點振蕩3次,每次不超過1 sec。 

    6、質粒轉化液可直接鋪板培養(yǎng),而連接或重組產(chǎn)物轉化時,冰上靜置5 min。 

    7、取全部轉化菌液鋪到提前預熱好的培養(yǎng)皿上,放置37℃培養(yǎng)箱過夜。 

    注意事項

    A、ECC細胞在半融化狀態(tài)下轉化效率更高,為避免使用時完全融化,請勿用水浴快速融化、勿用手緊捂著融化,而是用手指反復擦拭試管外壁使其融化,并隨時觀察融化狀態(tài)。一般1 min左右底部可見少量融化液體,融化約1/3時,立即用移液槍吸頭輕輕攪拌至可以吸取的狀態(tài),按DNA/ECC體積比<10%吸出需要量并立即加入到質粒DNA中(亦可以把預冷質粒、連接或重組產(chǎn)物直接加入半融化ECC中),依照建議方法混勻。批量轉化時,ECC細胞可冰浴融化,但融化后應盡快使用以免轉化效率下降。 

    B、ECC和質粒DNA混勻時,將渦旋儀轉速調至中檔可充分混勻且不損傷細胞,快速點振蕩3次,每次時間不要超過1 sec(避免用移液槍吹打、攪勻、或用手指彈勻,以免混勻不充分),立即鋪板培養(yǎng),或冰浴5-30 min,之后不需要熱激活即可鋪板培養(yǎng)。 

    C、在鋪板培養(yǎng)之前,ECC和質粒DNA混勻后適當延長冰浴時間(可至2 hr),以及培養(yǎng)板在室溫或37℃預熱30 min,都可以進一步提高轉化效率。若采用經(jīng)典轉化方法,ECC可獲得更高的轉化效率(>109)。 

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